IVD企業(yè)必爭(zhēng)之地“分子POCT”這是你知道的POCT嗎？

POCT（Point-of-care Testing），又稱(chēng)為即時(shí)檢測(cè)，其定義為在采樣現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測(cè)結(jié)果的一種檢測(cè)方式。1995年P(guān)OCT概念首次提出，POCT的出現(xiàn)能夠在快速取得檢測(cè)結(jié)果的同時(shí)免去了樣本的處理和數(shù)據(jù)分析等繁瑣的步驟，也不必再依賴(lài)于專(zhuān)業(yè)人員的操作，因此POCT 在醫(yī)療中的應(yīng)用迅速增加，小至自我測(cè)試和門(mén)診，大至重癥監(jiān)護(hù)病房，POCT 已應(yīng)用在了各種醫(yī)療場(chǎng)合中。

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）要求新建立的 POCT 方法應(yīng)符合“ASSURED”標(biāo)準(zhǔn)，即經(jīng)濟(jì)實(shí)惠（Affordable）、靈敏度高（Sensitive）、特異性好（Specific）、操作簡(jiǎn)單（User-friendly）、快速并可重復(fù)（Rapid and Robust）、無(wú)需儀器（Equipment-free）和易獲?。―elivered (to the end user)）。該標(biāo)準(zhǔn)首次提出于 WHO 的熱帶疾病研究和培訓(xùn)特別項(xiàng)目（WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases），同時(shí)POCT 應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院外由非實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行。

目前，POCT 不僅可用于血糖檢測(cè)和早期妊娠的檢測(cè)，還可用于心血管疾病、急慢性腎病、酸堿紊亂、感染性疾病、血液病、凝血功能障礙等方面的檢測(cè)。常用的POCT技術(shù)早期主要以定性檢測(cè)為主，包括膠體金、免疫層析、干化學(xué)技術(shù)等。后期隨著技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)檢測(cè)結(jié)果需求的逐步提升，以免疫熒光、上轉(zhuǎn)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、微流控技術(shù)等為核心的POCT產(chǎn)品快速發(fā)展并逐步應(yīng)用于臨床，實(shí)現(xiàn)了快速的定量檢測(cè)，提高了準(zhǔn)確性。

核酸分子檢測(cè)方法??

核酸分子檢測(cè)相對(duì)于抗原抗體檢測(cè)在準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。一場(chǎng)新冠疫情更是凸顯了其在傳染性疾病防控方面發(fā)揮著不可替代的作用。除了PCR之外，常見(jiàn)的核酸檢測(cè)方式還有以下幾種：

1、依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增NASBA

1991年Jean Compton首次提出NASBA，該方法以單鏈RNA為模板，在41℃恒溫條件下，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物來(lái)模擬體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病的的復(fù)制機(jī)制進(jìn)行目標(biāo)RNA的擴(kuò)增。90分鐘內(nèi)可以獲得10的12次方倍產(chǎn)物，其產(chǎn)物長(zhǎng)度在100到250個(gè)堿基，靈敏度最高達(dá)單個(gè)拷貝。

2、滾環(huán)擴(kuò)增RCA

RCA是一種在37℃下進(jìn)行的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，具體過(guò)程為一條鎖式探針與靶序列雜交后其在連接酶作用下連接成環(huán)，引物與環(huán)狀模板匹配后在Phi29 噬菌體DNA聚合酶作用下沿環(huán)延伸并不停置換先前產(chǎn)生的互補(bǔ)序列，最終產(chǎn)生重復(fù)的長(zhǎng)單鏈DNA。1小時(shí)內(nèi)其單一引物可產(chǎn)生1000倍放大效果。在此基礎(chǔ)上通過(guò)在產(chǎn)物上引入一至多條引物形成超支化RCA、將產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶切割后再連接成環(huán)作為RCA模板、將產(chǎn)物重復(fù)片段切開(kāi)后作為新的引物引發(fā)RCA擴(kuò)增等手段均可實(shí)現(xiàn)RCA產(chǎn)物指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增。

3、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP

LAMP由Tsugunori Notomi等人于2000年首次發(fā)表，針對(duì)模板六個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)的一對(duì)外引物F3、B3和一對(duì)內(nèi)引物FIP、BIP在具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst ，LavaLAMP等）作用下沿模板發(fā)生延伸和置換的循環(huán)。在60~65℃條件下1小時(shí)內(nèi)可以獲得10的9次方倍的擴(kuò)增產(chǎn)物，靶序列的最佳長(zhǎng)度在130-200 bp，最佳靈敏度大于10拷貝。在此基礎(chǔ)上，可以通過(guò)額外引入一對(duì)環(huán)狀引物可顯著提升其檢測(cè)靈敏度并加速反應(yīng)進(jìn)程將時(shí)間縮短至30分鐘內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)雙鏈嵌合染料對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，經(jīng)終點(diǎn)法瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)其電泳條帶呈梯形。后來(lái)又陸續(xù)開(kāi)發(fā)出了多種LAMP檢測(cè)方法如比濁法、鈣黃綠素法、羥基萘酚藍(lán)、pH響應(yīng)顯色、側(cè)流層析等。

4、解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增HDA

在體內(nèi)，DNA通過(guò)解旋酶、DNA聚合酶及各種輔助蛋白因子進(jìn)行復(fù)制，Vincent等人模仿這一過(guò)程開(kāi)發(fā)出了體外的解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增法。該方法原理，首先DNA雙鏈被DNA解旋酶（E. coli UvrD helicase）分離為單鏈并分別被單鏈結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合，之后兩條上下游特異性引物分別與模板雜交，在DNA聚合酶（exo- Klenow）的作用下延伸，合成新的雙鏈。在37℃條件下反應(yīng)1-2小時(shí)可獲得10的6次方倍的擴(kuò)增產(chǎn)物，其靶序列在400 bp范圍內(nèi)可以得到有效擴(kuò)增。后來(lái)有研究稱(chēng)可以將UvrD解旋酶與Bst-DNA聚合酶偶聯(lián)構(gòu)成一種雙功能蛋白，可顯著提升HDA反應(yīng)速率，并可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)2.3kb的片段擴(kuò)增。

5、重組酶聚合酶反應(yīng)RPA

2006年P(guān)iepenburg等人首次介紹了RPA反應(yīng)，目前該方法已有成熟商業(yè)化試劑盒推出市場(chǎng)?；A(chǔ)的RPA反應(yīng)主要有三種酶參與，包括重組酶（T4 uvsX）、聚合酶（Bsu）和單鏈結(jié)合蛋白（gp32）以及兩條特異性的上下游引物。具體擴(kuò)增機(jī)理如下，首先T4 uvsX在輔助因子uvsY的作用下與引物結(jié)合形成核酸蛋白復(fù)合物，之后該復(fù)合物尋找與靶標(biāo)DNA的互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)行雜交并置換下另一條單鏈，該單鏈馬上被gp32結(jié)合防止其再與互補(bǔ)鏈雜交。接下來(lái)與引物結(jié)合的T4 uvsX在ATP的作用下解離，引物在聚合酶Bsu作用下沿模板鏈延伸。該反應(yīng)在37-42℃下反應(yīng)，30分鐘內(nèi)可以獲得10的12次方倍拷貝的擴(kuò)增產(chǎn)物。其擴(kuò)增長(zhǎng)度在500bp以?xún)?nèi)最佳。

平臺(tái)類(lèi)型??

標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室具有嚴(yán)格的功能分區(qū)，包括核酸提取區(qū)、試劑準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)及產(chǎn)物分析區(qū)，qPCR的發(fā)展應(yīng)用可使擴(kuò)增區(qū)與產(chǎn)物分析區(qū)合并，但仍然需要較大的實(shí)驗(yàn)室空間，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)條件、負(fù)壓條件及樣本與人員流動(dòng)方向都具有一定的要求。除了實(shí)驗(yàn)室條件外，分子實(shí)驗(yàn)的操作及結(jié)果的判讀分析也具有一定的專(zhuān)業(yè)性，需要投入較大人力。使得常規(guī)的分子生物實(shí)驗(yàn)室的設(shè)立具有較高門(mén)檻，難以在各級(jí)診療機(jī)構(gòu)全面開(kāi)展。面對(duì)各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)于核酸檢測(cè)的需求甚至個(gè)人自測(cè)的需求，各式的核酸檢測(cè)POCT產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。受最適的應(yīng)用場(chǎng)景、檢測(cè)通量、檢測(cè)成本的影響，不同廠(chǎng)家在開(kāi)發(fā)分子POCT平臺(tái)時(shí)具有不同的側(cè)重點(diǎn)，因此所呈現(xiàn)的最終的產(chǎn)品形態(tài)也是百花齊放。

1、無(wú)儀器分子POCT

如Lucira Health新冠試劑中的檢測(cè)單元組件包含多個(gè)反應(yīng)腔室，可檢測(cè)新冠N基因的兩個(gè)非重疊區(qū)域，同時(shí)設(shè)置有一個(gè)陽(yáng)性?xún)?nèi)部質(zhì)控(Positive Internal Control, PIC)和一個(gè)裂解內(nèi)部質(zhì)控(Lysis Internal Control, LIC)。采集樣本后的拭子在樣本管洗脫液作用下，于室溫裂解釋放核酸；核酸進(jìn)入檢測(cè)單元的不同反應(yīng)腔室，執(zhí)行RT-LAMP反應(yīng)；反應(yīng)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致體系pH值改變，并可通過(guò)顯色劑呈現(xiàn)出顏色變化；檢測(cè)單元內(nèi)置的光電元件實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)體系的顏色變化，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀；由于反應(yīng)過(guò)程是實(shí)時(shí)檢測(cè)的，陽(yáng)性結(jié)果可在11分鐘內(nèi)顯示、陰性或無(wú)效結(jié)果則需在30分鐘后顯示。

2、微流控分子POCT

博奧將微流控技術(shù)與恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)完美結(jié)合，滿(mǎn)足當(dāng)前臨床診斷、食品安全等快檢領(lǐng)域高通量、經(jīng)濟(jì)、高效的需求。最快 20 分鐘即出結(jié)果，與 PCR 多孔板擴(kuò)增相比，反應(yīng)體系小，操作更簡(jiǎn)便，靈敏度可達(dá)10-1000拷貝。

3、自動(dòng)化分子POCT

Automolec 3000，不僅把核酸提取、純化、擴(kuò)增、檢測(cè)集成到了一臺(tái)機(jī)器上，還做到了“樣本隨來(lái)隨檢”。突破了以前高通量一體機(jī)只能按批量檢測(cè)的限制, 單個(gè)樣本隨來(lái)隨檢，首個(gè)結(jié)果100分鐘，之后2分鐘出一個(gè)結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)200測(cè)試/8小時(shí)，多項(xiàng)目同時(shí)載機(jī)測(cè)試，適用多樣本類(lèi)型。

分子POCT上游組件??

為實(shí)現(xiàn)上述各種形態(tài)的POCT產(chǎn)品，需要依托完整的工業(yè)體系，包括電子信息、機(jī)械工程、微流體通路設(shè)計(jì)、光學(xué)設(shè)計(jì)等，此外還有材料、化學(xué)、生物等的支持。

液路模塊是分子POCT產(chǎn)品最具挑戰(zhàn)的核心技術(shù)之一，常見(jiàn)的有管式、卡盒式、盤(pán)式、以及微流控芯片式。其中微流控芯片更是對(duì)當(dāng)前最先進(jìn)工藝的整合，其基質(zhì)從無(wú)機(jī)材料到有機(jī)材料均有覆蓋。而不同材料所制備的芯片往往適用于不同功能的生化分析需求。同時(shí)，不同材質(zhì)在加工方面的難易程度也成為人 們選擇芯片基質(zhì)的一個(gè)重要原因。最初的微流控芯片基質(zhì)是半導(dǎo)體行業(yè)中所常用的硅片，可通過(guò)干法刻蝕或濕法刻蝕進(jìn)行加工成型，在硅片表面形成不同的通 道與分區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)不同功能。雖然硅片不具透光性，導(dǎo)致多數(shù)基于光學(xué)的生化分析或熒光成像檢測(cè)難以應(yīng)用于硅質(zhì)芯片，但是可通過(guò)在芯片特定結(jié)構(gòu)部分添加金屬相來(lái)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，或者與透明材質(zhì)如玻璃的混用來(lái)解決光學(xué)檢測(cè)的問(wèn)題。

由于玻璃具有良好的光透過(guò)性，具有很低的熒光背景，而且可通過(guò)硅羥基在玻璃表面輕易進(jìn)行多種修飾改性，因此玻璃逐漸替代硅成為主要的無(wú)機(jī)硬質(zhì)微流控芯片材質(zhì)，同樣可采用濕法刻蝕或干法刻蝕進(jìn)行微結(jié)構(gòu)的加工。但是無(wú)論是以硅還是玻璃作為芯片的基質(zhì)，其加工制作工藝難度相對(duì)較大，需要大型儀器設(shè)備，成本較高，并不利于一次性檢測(cè)芯片的推廣應(yīng)用，而且開(kāi)發(fā)準(zhǔn)入門(mén)檻較高，也限制了其發(fā)展。因此更多的實(shí)驗(yàn)室將芯片的研發(fā)聚焦于有機(jī)材料如 PDMS，此類(lèi)材料借助陽(yáng)?？芍苯幼⑺艹尚停軌蝻@著降低單個(gè)樣本的檢測(cè)成本。

生物制劑則是液路系統(tǒng)之外另一核心技術(shù)。不同于常規(guī)分子診斷試劑，為了適配POCT的需求，反應(yīng)所需的生物酶、dNTP、鹽離子緩沖介質(zhì)等往往需要預(yù)載到卡盒或芯片的個(gè)功能腔室內(nèi)，而預(yù)載試劑的卡盒由于具有較大體積，且受卡盒基質(zhì)、預(yù)載試劑的多樣性如磁珠等特性的影響，以及儲(chǔ)存運(yùn)輸成本的限制，一般需要進(jìn)行4℃或常溫存放，這就對(duì)試劑的穩(wěn)定性和耐熱性提出了嚴(yán)格要求。